檢測水中滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的具體方法
今天我們要講的枯草芽孢桿菌黑色變種主要用于各類醫(yī)療機構(gòu)及制藥工業(yè)領(lǐng)域的消毒效果驗證中，其原理是經(jīng)過滅菌處置后含有枯草芽孢桿菌黑色變種的水樣在通過孔徑為0.45um的濾膜后，細菌和芽孢被截留在濾膜上，然后將濾膜置于酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上，36℃±1℃培養(yǎng)72h-96h 1.酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基 2.營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 3.淀粉培養(yǎng)基和碘液 4.硝酸鹽還原培養(yǎng)基和相關(guān)試劑 5.甘油復(fù)紅肉湯培養(yǎng)基。 6.甘露糖生化培養(yǎng)基 7.甘露醇生化培養(yǎng)基 8.苦杏仁苷生化培養(yǎng)基 9.革蘭氏染色液 10.芽孢染色液。 11.陰性對照菌：如地衣芽孢桿菌 12.陽性對照菌：枯草芽孢桿菌黑色變種 13.枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液 按照《消毒技術(shù)規(guī)范》的規(guī)定制備，也可購買濃度范圍在106CFU/ml-109CFU/ml之間的市售枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液 14.無菌濾膜：直徑50mm，孔徑0.45μm的醋酸纖維濾膜 按無菌操作要求包扎 15.石蠟質(zhì)封口膜 16.無菌水：取適量實驗級純水，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min 1.樣品瓶：螺口帶蓋或磨口具塞的250ml 2.恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃ 3.高壓蒸汽滅菌器：121℃，可調(diào) 4.pH計：準確到0.1pH單位或更高精度。也可使用pH精密試紙。 5.顯微鏡：物鏡4×或5×、10×、20×、40×，油鏡100×，目鏡10×或15×。 6.分析天平：實際分度值0.0001g 7.培養(yǎng)皿：直徑90mm。 8.過濾裝置：配有砂芯濾器 9.接種環(huán)：直徑1mm-3mm。 10.鑷子：不銹鋼或一次性無菌塑料鑷子 11.刻度移液管：1ml、10ml 12.量筒：100ml 13.錐形瓶：100ml。 14.酒精燈 15.試管：10ml。 16.無菌操作設(shè)備：無菌室 17.一般實驗室常用儀器和設(shè)備。 評價使用高溫高壓滅菌設(shè)備的滅菌效果時，取樣品瓶，加入枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液及200ml無菌水使混合液中枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢終濃度達到5×104CFU/ml-5×105CFU/ml。滅菌處置完畢后，取出樣品瓶，對水樣進行滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的檢測。 評價使用其它滅菌設(shè)備的滅菌效果時，滅菌前取適量枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液加入滅菌設(shè)備，使水樣中枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢終濃度達到5×104CFU/ml-5×105CFU/ml。滅菌處置完畢后，從滅菌設(shè)備中采集水樣，進行滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的檢測。采樣量一般為樣品瓶容量的80%左右，不得用樣品洗滌樣品瓶。樣品采集完畢后，迅速用無菌包裝紙包扎樣品瓶。 樣品采集后宜在2h內(nèi)檢測，否則應(yīng)在10℃以下冷藏保存運輸，但不得超過6h。實驗室接收樣品后，不能立即開展檢測的，樣品應(yīng)在4℃以下冷藏保存 用無菌鑷子以無菌操作夾取無菌濾膜貼放在已滅菌的過濾裝置上 用滅菌鑷子夾取濾膜移放在酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后用石蠟質(zhì)封口膜封好培養(yǎng)皿，倒置培養(yǎng)皿，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)72h-96h。 培養(yǎng)96h后，如培養(yǎng)基上未有菌落生長，則試驗終止；如培養(yǎng)基上有菌落生長，則挑取黑色的特征菌落于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，36℃±1℃培養(yǎng)24h，待鑒定。同時將已挑菌落的酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿儲存于2℃-5℃，以備必要時復(fù)查。 挑取黑色或可疑菌落，分別使用革蘭氏染色液和芽孢染色液染色，枯草芽孢桿菌黑色變種革蘭氏染色鏡檢以及芽孢染色鏡檢可以參考相關(guān)鏡檢圖 挑取黑色或可疑菌落 用無菌水按照過濾和培養(yǎng)步驟進行操作；培養(yǎng)96h后平板培養(yǎng)基上應(yīng)無菌落生長，否則，該次樣品鑒定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新采樣和檢測。 將陰性對照菌和陽性對照菌制成濃度為40CFU/L-600CFU/L的菌懸液，分別按照過濾、培養(yǎng)、實驗的步驟操作。陰性、陽性對照菌呈現(xiàn)的生化反應(yīng)結(jié)果應(yīng)與參照表所列結(jié)果一致，否則該次水樣鑒定結(jié)果無效，此時查明原因后重新采樣和檢測。 100ml水樣中檢出枯草芽孢桿菌黑色變種，即可斷定滅菌不合格檢測所用試劑
檢測所需試劑
水樣采集
水樣過濾
培養(yǎng)流程
染色鏡檢
生化實驗
空白對照實驗
陰性及陽性對照
、陽性菌株應(yīng)承現(xiàn)的生化反應(yīng)結(jié)果" width="750" />結(jié)果判斷
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